人α属冠状病毒主要感染上呼吸道，是秋冬季节性普通感冒的常见病原体。其中人冠状病毒229E（HCoV-229E）广泛流行，多引起轻度症状，但在婴幼儿、老年人和免疫功能低下人群中可致下呼吸道疾病。该病毒在上呼吸道（约33℃，低于核心体温37℃）复制，经“人体—外环境—人体”路径传播，经历显著的温度波动。α属冠状病毒感染宿主细胞依赖其表面刺突（S）蛋白完成受体识别并驱动膜融合，但是其如何被激活尚不清楚。以往基于可溶性重组蛋白的研究无法模拟真实膜环境，因而不能充分回答上述问题。
11月4日，清华大学生命科学学院李赛课题组在《科学·进展》（Science Advances）杂志发表题为“病毒粒子原位结构动力学揭示α冠状病毒刺突蛋白受温度和受体协同调控的激活”（On-virion structural dynamics reveal temperature- and receptor-coordinated activation of an alphacoronavirus spike）的研究论文。团队利用冷冻电子断层成像（cryo-ET）和子断层平均技术（STA），在生理相关温度和受体存在条件下，直接从完整HCoV-229E病毒颗粒上观测了S蛋白的构象动态，揭示了温度与受体结合协同驱动α冠状病毒S蛋白激活的机制。
团队首先比较了HCoV-229E在33℃与37℃下的扩增效率，发现33℃培养所得病毒滴度显著高于37℃。这与既往“37℃下病毒复制减弱”的报道一致，说明HCoV-229E在接近人体上呼吸道的生理温度（约33℃）下具有更好的体外扩增表现。免疫荧光结果显示，4℃保存的病毒在33℃感染Huh-7细胞时，入侵时间窗约为8 h。在此基础上，团队通过温度变化、孵育时间、引入可溶性受体等条件模拟病毒在感染不同阶段的环境，并通过cryo-ET和STA表征了不同感染阶段的病毒。
温度驱动的S2亚基可逆构象转换
病毒表面的S蛋白结构显示，S 蛋白的 S2 亚基在病毒颗粒表面存在“紧凑型”（S2-compact）与“松散型”（S2-loose）两种融合前构象，二者可随温度变化发生可逆转换：在33℃下扩增产生的HCoV-229E病毒颗粒表面的 S 蛋白全部呈现S2-loose构象；将33℃下扩增的病毒颗粒在 4℃ 下孵育24h，病毒颗粒表面的 S 蛋白全部转为S2-compact构象；再次升温至33℃后，部分S蛋白又转为S2-loose构象，且该比例随孵育时间延长而升高。此前基于HCoV-229E S蛋白可溶性胞外域的将病毒研究中分别报道了这两种构象[1][2]，而本研究则发现这两种构象的S蛋白能在完整野生型病毒表面共存。分类结果显示，在S2-loose构象的S蛋白中，RBD 抬起的比例高于S2-compact构象的S蛋白。由于α冠状病毒的S1采用“intra-unit”排布，RBD的抬起受到相邻NTD的空间限制，而S2-loose状态下更为松散的组装可 能有助于RBD的抬起。
图一 未结合受体hAPN（A-D）或 hAPN 共孵育（E）的 HCoV-229E 病毒颗粒上融合前 S 蛋白的结构（A-D图中，青色为S2-compact型S蛋白，橙色为S2-loose 型S蛋白）温度驱动的 S2 亚基可逆构象转换（F）
受体诱导的HCoV-229E病毒颗粒上S蛋白构象变化
尽管S2-loose构象能够促进RBD抬起，但在未结合受体的病毒颗粒上，RBD抬起构象的S蛋白数量仍很少，因此仅靠温度驱动不足以把RBD稳定在抬起位置。于是团队进一步探究了受体对病毒表面S蛋白的影响。在33℃加入可溶性人氨基肽酶N（hAPN）胞外域后，S2-compact与S2-loose两种构象的S蛋白中均可观察到处于抬起状态的RBD，提示受体结合可稳定RBD的抬起。将病毒颗粒与可溶性hAPN在33℃共孵育延长至24 h后，团队在完整病毒颗粒表面直接捕捉到两类S-hAPN复合物：单个hAPN二聚体结合一个S三聚体的“Solo复合物”，以及一个hAPN二聚体以双价方式同时桥接两个相邻S三聚体的“Gemini复合物”。后者为此前基于可溶性蛋白提出的结构模型提供了直接的原位证据[3]。这一结构证据提示，受体二聚体可同时结合相邻 S 蛋白，这种双价结合方式可能通过多价相互作用增强病毒与宿主细胞之间的附着亲合力，并有助于促进 S 蛋白介导的膜融合。
图二 hAPN 诱导的HCoV-229E病毒颗粒上S蛋白构象变化及两个相邻S三聚体“Gemini复合物”的结构
温度与受体协同促进融合前构象向融合后构象转变
分类结果表明，温度与受体结合在驱动S蛋白由融合前向融合后转变的过程中具有协同效应。在无受体条件下，4℃与33℃孵育24 h的融合后S蛋白比例均很低，温度单独作用影响有限；加入hAPN后，融合后S蛋白比例较同温度无受体对照组升高，在33℃升高更为显著。
基于这些发现，团队提出了HCoV-229E S蛋白激活的温度-受体协同调控模型：低温下S蛋白以RBD-closed、S2-compact构象为主；升温至33℃后S蛋白逐步转变为S2-loose构象；在两种S2构象中S蛋白均可自发抬起RBD，从而结合受体并形成Solo或Gemini复合物；受体结合进一步促进 S1解离和S2重排 ， 最终驱动膜融合和融合后构象的产生。
图三 HCoV-229E S 蛋白激活的温度-受体协同调控模型
该研究在完整病毒颗粒表面系统揭示了温度和受体如何协同调控α冠状病毒S蛋白的构象动态，为理解α冠状病毒的感染机制提供了结构视角，也为理解 HCoV-229E 对上呼吸道温度环境的适应性，以及其季节性流行特征提供了新的结构生物学视角。研究还指出，S2 亚基构象受温度调控的特性使其成为潜在的抗原靶点，基于S2-loose构象的免疫原设计可能为 α 冠状病毒疫苗研发提供新思路。
李赛副教授为本文通讯作者，清华大学膜生物学全国重点实验室、生命科学学院2025届博士毕业生梁佳明、博士后彭程、2025级博士生谭瑞骁为本文共同第一作者。清华大学生命科学学院王新泉教授团队参与了本研究。相关研究工作得到了国家自然科学基金委员会等机构的资助。感谢清华大学蛋白质科学技术中心冷冻电镜设施的雷建林博士、杨帆博士和周昵昀博士在冷冻电镜数据采集方面的支持；感谢生物计算平台集群的计算设施支持，以及BSL-2公共设施（中国蛋白质科学北京中心清华大学分中心）的支持。
参考文献
[1] X. Y. Song, Y. J. Shi, W. Ding, T. X. Niu, L. M. Sun, Y. B. Tan, Y. Chen, J. L. Shi, Q. Q. Xiong, X. J. Huang, S. B. Xiao, Y. P. Zhu, C. Y. Cheng, Z. F. Fu, Z. J. Liu, G. Q. Peng, Cryo-EM analysis of the HCoV-229E spike glycoprotein reveals dynamic prefusion conformational changes. Nat. Commun. 12, 141 (2021).
[2] Z. Li, A. C. Tomlinson, A. H. Wong, D. Zhou, M. Desforges, P. J. Talbot, S. Benlekbir, J. L. Rubinstein, J. M. Rini, The human coronavirus HCoV-229E S-protein structure and receptor binding. eLife 8, e51230 (2019).
[3] Y.-X. Tsai, Y.-C. Chien, M.-F. Hsu, K.-H. Khoo, S.-T. D. Hsu, Molecular basis of host recognition of human coronavirus 229E. Nat. Commun. 16, 2045 (2025).
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aef6880
