冷冻电子断层成像技术（cryo-ET）结合子断层平均（STA）技术，是原位结构生物学的关键技术。然而，根据EMDB统计，cryo-ET每年仅贡献约10%的电镜结构。现代化高分辨cryo-ET数据处理流程含多个步骤，每个步骤均有多个软件和参数需要筛选和反复试错，导致每个实验室都需要搭建自己的数据处理方案，且目前主流软件生态体系由欧美团队主导。
2026年7月28日，清华大学生命学院李赛团队在《自然·通讯》（Nature Communications）发表题为“FlyTomo：一款用于cryo-ET的实时流式数据处理及诊断软件”（FlyTomo: a streamlined software for on-the-fly cryo-ET data processing and diagnosis）的研究论文。FlyTomo可以在采集过程中自动化实时分析数据，几分钟内告诉用户样品和显微镜状态，让宝贵的机时不再依赖"事后发现问题"。通过发布FlyTomo，团队希望将cryo-ET从少数团队掌握的门槛技术，转变为更多生命科学研究者的通用工具。
FlyTomo的设计理念
FlyTomo提供了一个高通量、用户友好的数据处理平台，支持从运动校正到子断层平均的一体化数据分析。传统cryo-ET实验中，研究人员通常需要等到全部数据采集结束后，经过数天甚至数周的数据处理，才能判断样品质量、显微镜状态以及数据是否满足结构解析要求。这种 “事后发现问题” 的模式往往会导致昂贵的电镜机时被白白浪费。
FlyTomo改变了这一流程。
软件能够在数据采集过程中自动完成运动校正、倾转序列重建、断层重建等处理，并在每组数据采集完成后的数分钟内生成断层图像和关键质量指标。研究人员无需等待完整数据处理结束，即可实时了解显微镜状态、样品质量以及目标结构的保存情况，并根据反馈及时调整采集策略，避免继续采集质量欠佳的数据。这种"边采集、边分析、边反馈"的工作模式，将原本滞后的数据分析提前到了实验现场，大幅提升实验效率。
图1.FlyTomo通过实时诊断中间结果（绿色模块），大幅提升实验效率、降低问题数据比例
一体化流程：从“手动衔接”到“高效贯通”
传统cryo-ET流程中，数据在每个步骤之间都需要人工转换格式，针对数据处理步骤碎片化、手工干预繁琐的痛点。FlyTomo具有图形界面，打通了原本割裂的计算环节，实现从原始数据到结构计算的一体化衔接。
图2.FlyTomo GUI界面
·细胞薄片定制流程：预置参数与厚度筛选
针对冷冻细胞薄片有pretilt，厚度、污染不均一等问题，FlyTomo内置了实验室开发的冰层厚度智能检测方法。通过“冰层厚度测量-倾转系列对齐” 的自动迭代处理，协助用户轻松评估样品质量、大规模筛选优质数据，实现对细胞薄片倾转系列对齐效果与断层图像质量的提升。
·电镜实验中模块（In-EM-Session）：实时诊断，拒绝“盲采”
依托软件的高效计算，在单个倾转系列拍摄完成后的数分钟内，软件即可呈现降噪的断层图像以及关键诊断指标，直接为用户提供多维度监控仪器状态并获取生物靶标结构，避免收集次优数据。
·电镜实验后模块（Off-EM-Session）：交互式问题精修
在数据采集结束后（Off-EM-Session），数据处理往往难以做到100%准确，而传统做法需要手动筛查和处理问题图像，极其耗时耗力。FlyTomo 可识别问题数据并预警，用户可直接在GUI界面完成交互式修正，提高了筛选问题数据的准确率和数据处理效率。
FlyTomo的测试与应用
多类型样品、多电镜型号的严格测试
为检验软件在真实生物学场景下的性能，研究团队在多种显微镜和相机系统上对FlyTomo进行了严格验证。以下所有体系均是真实cryo-ET样品，由研究团队制备并采集数据，并用FlyTomo处理。
图3.FlyTomo测试样品与结果
·高度柔性组装的巨型分子机器：
Cryo-ET的一大类应用，是在生物膜表面直接解析大分子结构，或者难以在体外重组表达、高度柔性组装的大分子机器的完整结构，例如囊膜病毒、核孔复合物等。FlyTomo内置了专门针对这类体系设计的参数和策略。
为测试这类样品，团队表达提纯了HCoV-229E冠状病毒，并在数据收集开始起第85.7小时便从病毒表面重构出分辨率为5.6 Å的S蛋白结构。并最终通过Off-EM-Session模块将结构分辨率提升至3.9 Å。
·冷冻细胞薄片：
Cryo-ET的另一大类应用，是在细胞、组织等更大尺度样品中获得三维体数据，解析原位结构。
得益于FlyTomo针对细胞薄片的厚度筛选与迭代对齐功能，在测试此类复杂样品时，研究团队在cryo-FIB减薄的冷冻酵母细胞薄片中，成功将核糖体原位解析至4.3 Å分辨率，且大部分区域达到Nyquist极限分辨率。
·问题电镜、问题数据的挽救：
在实际实验中，研究者常因判断失误采集到有缺陷的数据，虽不舍删除却又不知如何有效利用。为测试这类情景，团队选用了一组在稳定性欠佳的电镜上采集的数据，该数据集混杂了七种不同的倾转方案。
通过FlyTomo的诊断，研究人员筛选出213套TS，最终获得了7.3 Å的Gn-Gc五聚体结构，分辨率超过使用单颗粒局部重构法在同台电镜数据集上获得的结构。这充分表明，FlyTomo具备从欠佳数据中“沙里淘金”、挽救珍贵样本的强大实力。
真实cryo-ET项目应用
在开发历程中，FlyTomo已被频繁应用于真实项目。它尤其适合三类应用场景。
·高分辨率原位结构
1.Hong, Y., Liu, S., Liang, R., Wang, K., Zhang, J., Peng, C., Zhu, Z., Zhang, Z., Zhang, W., Huang, B., et al. (2026). Architecture of a portal complex embedded in the poxvirus core. bioRxiv, 2026. DOI:10.64898/2026.06.09.730874.
2.Zhang, Y., Li, S., Zeng, C., Huang, G., Zhu, X., Wang, Q., Wang, K., Zhou, Q., Yan, C., Zhang, W., et al. (2020). Molecular architecture of the luminal ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex. Cell Res 30, 532–540. 10.1038/s41422-020-0320-y.
3.Yao, H., Song, Y., Chen, Y., Wu, N., Xu, J., Sun, C., Zhang, J., Weng, T., Zhang, Z., Wu, Z., et al. (2020). Molecular Architecture of the SARS-CoV-2 Virus. Cell 183, 730–738 e713. 10.1016/j.cell.2020.09.018.
·高度异质性、多构象的原位结构
4.Yao, H., Song, Y., Huang, Q., Zhu, M., Liang, J., Zhang, Z., Zhang, X., Dong, D., Shi, D., Wu, Z., et al. (2026). Cryo-ET of IgG bivalent binding on SARS-CoV-2 provides structural basis for antibody avidity. Nat Commun. 10.1038/s41467-026-71631-5.
在新冠病毒与多种完整IgG孵育后的样品上，从12个样品条件下解析出共计24个结构。通过比较，分析出IgG的结合规律。
5.Chen, Y., Zhang, Z., Zhao, Z., Liu, H., Zhao, H., Liang, R., Peng, C., Xu, J., Song, Y., Tan, X., and Li, S. (2026). A Dynamic Oligomerization Network Coordinates Hemagglutinin-Mediated Membrane Fusion on Influenza Virions. bioRxiv, 2026. DOI:10.64898/2026.03.23.713829.
在流感病毒上揭示了HA三聚体相互作用形成的三种二聚体构象，以及二聚、五聚和六聚等多样化寡聚组织，为理解流感病毒膜融合的协同性机制提供了结构基础。。
6.Liang, J., Peng, C., Song, Y., Zhang, Z., Yu, J., Wang, X., and Li, S. (2026). On-virion structural dynamics reveal temperature- and receptor-coordinated activation of an alphacoronavirus spike. bioRxiv, 2026. DOI:10.64898/2026.01.02.697259.
在HCoV-229E冠状病毒表面，从7个样品条件下解析出共计16个结构。通过比较，分析出229E S蛋白随温度、受体影响的构象变化规律。
7.Chen, M., Song, Y., Zhang, S., Zhang, Y., Chen, X., Zhang, M., Han, M., Gao, X., Li, S., and Yang, M. (2025). Molecular architecture of mammalian pyruvate dehydrogenase complex. Protein Cell 16, 72–78. 10.1093/procel/pwae044.
·细胞原位结构
8.Dong, D., Song, Y., Wu, S., Wang, B., Peng, C., Zhang, W., Kong, W., Zhang, Z., Song, J., Hou, L.H., and Li, S. (2025). Molecular basis of Ad5-nCoV vaccine-induced immunogenicity. Structure 33, 858–868 e855. 10.1016/j.str.2025.02.009.
在被腺病毒载体疫苗接种的细胞表面直接解析出高密度分布的S蛋白结构，从原位结构层面评估了疫苗的抗原性。
软件使用和反馈
FlyTomo当前发布版本为v3.0.1，运行环境要求Linux系统，建议在配备NVIDIA GPU（CUDA 11.0以上）的计算节点上运行。安装指南及测试数据详见https://github.com/SaiLi-Lab/FlyTomo。
作为一款致力于降低cryo-ET使用门槛的通用工具，FlyTomo的持续迭代离不开活跃的用户生态。李赛课题组致力将FlyTomo的GitHub主页打造成一个开放、互助的cryo-ET数据处理交流社区。技术支持将统一集中在GitHub Issues板块（https://github.com/SaiLi-Lab/FlyTomo/issues）进行。欢迎在Issues中发帖交流（英语优先），开发团队将积极回复。
作者与致谢
清华大学生命学院副教授李赛为该研究的通讯作者。清华大学生命学院2025级博士研究生张哲源与博士后彭程为共同第一作者。清华大学生命学院2023级博士研究生张伟平、2025届博士毕业生梁佳明、2023级博士研究生刘可欣、博士后陈勇(已出站)、博士后张俊霞(已出站)、博士后梁瑞和博士后宋雨桐(已出站)为软件测试、反馈和数据提供做出了大量工作。
特别感谢清华大学蛋白质科学研究中心冷冻电镜平台的雷建林、杨帆、周昵昀与李晓敏，以及国家多模态跨尺度生物医学成像中心的黄小俊、曾俨、赵容与李硕果，在样品制备与数据收集方面提供的技术支持。感谢国家蛋白质科学中心（北京）清华大学分中心生物计算平台为本研究提供的集群计算资源保障。此外，感谢赫尔辛基大学Juha Huiskonen教授协助我们测试RVFV数据集（于英国牛津大学结构生物学分部收集），以及清华大学李雪明课题组与陈柱成课题组提供测试样品。
本研究得到国家自然科学基金委、清华大学生命科学学院、膜生物学国家重点实验室、北京生物结构前沿研究中心、清华-北大生命科学联合中心的合力支持；国家自然科学基金cryo-ET重点专项（32241031）和清华大学笃实基金的资金支持。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-75998-3
