猴痘疫情回顾
2022年爆发的猴痘疫情已蔓延至全球123个国家和地区，截止至2024年9月，实验室确认的感染病例累计已超10.9万例，导致236人死亡。世界卫生组织在2022年和2024年两度就猴痘疫情发布最高级别预警，宣布其构成“国际关注的突发公共卫生事件” （public health emergency of international concern, PHEIC）。导致本次疫情的猴痘病毒属于痘病毒科正痘病毒属，同属还有天花病毒、牛痘病毒等。猴痘病毒有多种天然宿主，既可人际传播也可在野生动物中或在人和野生动物间发生跨物种传播，因此更加难以根除。人类感染猴痘病毒的主要症状包括淋巴结肿大、发热和全身脓疱，严重者可导致死亡。目前尚无针对猴痘的特效药物。2022年9月，我国重庆确诊中国大陆首例境外输入猴痘病例，截至2024年7月底，我国（含港、澳、台地区）已报告确诊病例2567例。至今，我国主要流行的猴痘病毒属于毒性相对较弱的clade IIb分支下的B.1和C.1毒株，这也是全球范围内传播较广、感染数量较多的两个代表性毒株。近期非洲地区爆发的clade Ib分支毒株呈现更强、更多样的传染性，且感染病程更长、病症更重。本工作研究的是clade IIb分支毒株。
猴痘病毒冷冻电镜照片
猴痘病毒是一种直径可达350 nm的巨型囊膜病毒。它拥有近200 kbp的双链DNA基因组，编码了180余种蛋白质，相较于其他病毒而言组分构成极其复杂且体型庞大。加之其高致病性及传染性特征，至今尚无完整、真实猴痘病毒粒子的冷冻电镜照片或结构公开。
2024年10月22日，清华大学生命学院李赛课题组与中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所应急技术中心谭文杰团队在《细胞 · 发现》（Cell Discovery）期刊合作发表了题为“猴痘成熟病毒粒子的分子构造”（Molecular Architecture of Monkeypox Mature Virus）的研究工作。该工作揭示了灭活猴痘病毒成熟病毒粒子及其内核上栅栏蛋白与孔道复合物的原位结构与组装模式，并首次报道了2022-2023年流行的两个代表性猴痘病毒毒株中存在异常组装模式的现象。
研究团队在中国疾病预防控制中心BSL-3实验室内分离培养猴痘病毒并充分灭活。灭活样品经多轮验证并确认完全失去感染性后，被密封运送至清华大学BSL-2实验室进行实验。为了在保留真实病毒形貌的同时克服成像衬度、样品丰度等方面的挑战，研究团队优化调整了病毒粒子的提纯方案，得到高纯度、高丰度、高分散性、无感染性但又保留了完整病毒形态的猴痘病毒粒子样品。团队首先对中国大陆首个输入性病例的猴痘病毒毒株（clade IIb B.1）进行了冷冻电子断层成像（cryo-ET），发现大部分病毒粒子呈“圆饼”状，其长轴和短轴长度约为310 nm和270 nm。病毒的基因组被包裹在一个完整的、形似红细胞的两面凹内核中，内核壁由外层的栅栏状蛋白和下方的内壁蛋白组成；在内核的两侧各有一个含大量蛋白的侧体，侧体和内核一起被包裹在一层囊膜内，囊膜表面覆有密集的病毒刺突蛋白（图1）。
图1：猴痘病毒成熟病毒粒子的冷冻电子断层图像（正面及侧面）
猴痘病毒内核结构
通过子断层平均（sub-tomogram averaging）方法，团队解析了这些常规形态病毒粒子内核上栅栏蛋白的原位结构（图2，i）。该结构在整体上与Alphafold2预测的A10三聚体拟合良好，但局部体现出一定的差异性。首先，其顶部横截面处可见每个A10单体亚基侧面均存在一未知的多余密度与相邻亚基相连。其次其中心横截面处未呈现出预测的连接密度。前人研究已发现该连接密度在痘苗病毒（VACV）的栅栏蛋白中真实存在。结合猴痘病毒与痘苗病毒的序列比较，推测该结构差异可能与猴痘病毒在两亚基相互作用界面上携带的氨基酸突变导致的电荷变化有关。
通过分析栅栏蛋白的组装规律，研究团队发现它们可灵活地排布成单元间距约为9 nm的蜂巢状结构（图2，ii）。在内核上，团队也发现了花朵状的孔道复合体（图2，iii）。这些孔道复合物由六个栅栏蛋白围绕一个孔道复合物构成，并局部扰乱周边栅栏蛋白的蜂巢状排列模式。这些看似随机分布的花朵状孔道复合物可能与病毒早期转录阶段的物质进出有关。
图2：猴痘病毒内核表面栅栏蛋白与孔道复合体的结构和组装模式
完整猴痘成熟病毒粒子的分子构造
基于解析得到的蛋白结构和分布，团队将一颗代表性猴痘成熟病毒粒子进行重构，得到病毒分子构造模型（图3）。该模型在分子层面展示了真实猴痘成熟病毒粒子的结构和组装规律。
图3：代表性猴痘病毒成熟病毒粒子的分子构造模型
然而，以上所示的常规形态猴痘病毒仅占据全部病毒粒子约60%的比例，其余近40%病毒粒子则与以往报道的正痘病毒形态不同，其内核壁折叠成扁平囊状、卷曲层状或形成多个独立的小核，病毒内部的内核构造并不似红细胞一样闭合且双面凹陷。
图4：异常形态猴痘病毒粒子的电子断层图像与内核壁折叠模式
为了判断异常形态病毒是否广泛存在，研究团队又对C.1毒株进行了同样的观测。这一毒株分离自中国大陆首例本土传播病例，其出现晚于B.1毒株，自2023年中逐渐成为主要流行毒株之一。研究团队发现，尽管C.1毒株也存在类似的异常形态颗粒，其出现率却显著低于B.1毒株（图5）。这表明该毒株的内核组装成功率显著提升，一定程度上反映出伴随着2022-2023年的流行传播，clade IIb猴痘病毒可能发生了适应性进化并逐渐形成了更加高效的内核组装机制。
图5：C.1毒株中异常形态猴痘病毒粒子出现率显著低于B.1毒株
展望
本研究通过揭示真实猴痘病毒的分子构造，发现2022年至今主要流行的两个代表性毒株存在不同比例的异常形态病毒粒子，提示猴痘病毒在内核组装方面可能发生了适应性进化。然而其他猴痘病毒分支与毒株，特别是2024年8月爆发的clade Ib分支毒株是否存在类似特征，这些异形病毒颗粒的形成机制，及这些毒株的形态是否和致病性存在关联等问题还有待进一步探索。此外，本研究主要揭示了猴痘病毒内核表面的分子构造，但更多结构细节，如内核中基因组如何组装、囊膜表面刺突蛋白的结构和分布规律，猴痘主要抗原与受体、中和抗体的结合机制等是下一步的研究重点。
清华大学生命学院、北京生物结构前沿研究中心、清华-北大生命联合中心、膜生物学国家重点实验室李赛副教授和中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所应急技术中心谭文杰主任为本研究共同通讯作者。清华大学生命学院2021级博士研究生洪烨、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所应急技术中心黄保英研究员和清华大学生命学院、清华-北大生命联合中心博士后张俊霞博士为本研究共同第一作者。另外，李赛课题组2020级博士研究生彭程和2021级博士研究生孔维正参与了部分工作。
本工作得到了国家蛋白质科学研究（北京）设施清华基地冷冻电镜平台，生物计算平台，细胞影像平台和公共生物安全二级实验平台的技术支持。同时，本研究得到了国家自然科学基金，清华大学春风基金，清华大学笃实基金，清华-北大生命联合中心、北京生物结构前沿研究中心、膜生物学国家重点实验室等支持。特别感谢雷建林博士、杨帆博士、李晓敏博士在冷冻电镜数据采集方面提供的帮助；感谢刘冰钰博士在图像处理软件方面提供的帮助。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41421-024-00741-5
