RNA具有多种重要的生理功能，可在遗传编码、基因表达、基因调控和酶催化等过程发挥作用。RNA功能的发挥与其可折叠形成复杂的三维空间结构以及构象的动态变化密切相关，在结合配体(例如蛋白质、DNA/RNA、小分子等)或响应环境 (例如离子浓度、温度、pH或机械力)变化时，RNA往往发生构象状态的转变。研究表明，RNA的三维空间结构通常是在二级结构的基础上，由共轴堆积、假结结构(pseudoknot)、A-小沟模体(A-minor motif)以及“吻式”发夹(kissing loop)等三级相互作用模体(tertiary interaction motifs)稳定的。当前，人们对相关三级相互作用如何调控RNA的构象动态以实现RNA的多种生理功能的机制了解甚少。
黄病毒包括登革病毒、寨卡病毒和西尼罗河病毒等可在人群中引起感染，并导致一系列潜在的严重疾病。由于仍缺少有效的药物和疫苗，黄病毒的传播仍持续在全球形成健康威胁。黄病毒抗核酸外切酶RNA(xrRNA)是一类位于黄病毒基因组3’非翻译区的RNA结构元件(图1a)，可以折叠成独特的环状结构(图1b)，并抵抗宿主5’→3’核糖核酸外切酶Xrn1的降解，导致宿主细胞中亚基因组RNA(sfRNA)的形成与积累，后者与病毒的致病性和免疫逃逸密切相关。研究表明，在黄病毒家族中，xrRNA的一级序列与高级结构都是高度保守的。在稳定其环状高级结构的三级相互作用模体中，存在两个假结结构PK1和PK2，其中PK1的长度为2 bp，而PK2的长度从2-7 bp不等(图1c)。黄病毒xrRNA的PK2长度变化的生理意义，包括对xrRNA的结构、构象动态以及抵抗Xrn1的降解功能的影响尚不清楚。
2021年11月5日，清华大学生命学院方显杨与陈春来课题组合作，在《自然通讯》 (Nature Communications)在线发表了题为“假结长度调控黄病毒xrRNA的折叠、构象动态与抗Xrn1酶切活性”(Pseudoknot length modulates the folding, conformational dynamics, and robustness of Xrn1 resistance of flaviviral xrRNAs)的研究论文。在该项研究中，方显杨与陈春来课题组合作发展了基于非天然碱基系统的长链RNA位点特异性荧光探针标记方法，揭示了黄病毒xrRNA的PK2长度变化对其折叠、构象动态和抗酶切活性调控的分子机制，相关研究成果为应用单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术开展长链RNA的构象动态与功能关系的研究以及拓展黄病毒xrRNA在生物医学和生物材料中的潜在应用奠定了基础。
smFRET技术是研究生物大分子构象动态的重要手段，其应用前提是实现生物大分子位点特异性的荧光探针标记 (图2a)，而RNA特别是长链RNA的位点特异性荧光探针标记十分具有挑战性。在该研究中，基于非天然碱基系统(NaM-TPT3) (图2b)，研究者首先发展了长链RNA位点特异性荧光探针标记方法，通过重叠延伸PCR及体外转录, 分别向DNA模板和RNA转录本的特定位点引入非天然碱基对和炔基修饰的TPT3，进一步通过点击化学反应将叠氮修饰的荧光探针与炔基修饰的RNA耦联，从而实现对RNA的位点特异性荧光探针标记(图2c-d)。该标记技术突破了传统标记方法如化学合成等对RNA分子量的限制，可以高效、快速的实现对长链RNA位点特异性的荧光探针标记，将极大的推动smFRET技术在长链RNA构象动态研究中的应用。
图1. 黄病毒xrRNA的PK2假结长度变化调控其构象动态和抗酶切活性的分子机制。
接下来，研究者整合小角X射线散射(SAXS)、smFRET以及抗Xrn1酶切动力学实验技术，研究了来自黄病毒家族的11种PK2长度不同(2-7 bp)的xrRNA在溶液中的折叠、构象动态及抗Xrn1酶切活性(图1d-f)。SAXS和酶切实验数据表明，xrRNA在溶液中的折叠(图1d)和抗酶切活性(图1e)均高度依赖于[Mg2+]，并且受到PK2长度的调控，PK2长度较长的xrRNA在较低的Mg2+浓度即可折叠为环状高级结构并具备抵抗酶切的能力。smFRET实验数据表明(图1f)，xrRNA在溶液中是高度动态的，存在未折叠态、中间态及折叠态三种状态，三种状态的比例分布受到[Mg2+]及PK2长度的协同调控，其动力学遵循由未折叠态到中间态再到折叠态的折叠路径。xrRNA在折叠态的比例与酶切降解速率之间的负相关性表明，xrRNA只有进入折叠态时才能抵抗酶切，并且受到解折叠动力学过程(由折叠态到中间态或未折叠态)的控制，因而，xrRNA的结构、构象动态与其抗酶切功能密切相关。进一步的研究表明，在高[Mg2+]条件下，PK2较长的xrRNA可以缓解因三级相互作用模体如PK1或J2/3的突变而对其结构、动态特性和抗酶切活性的影响。综合这些实验结果，研究者们提出了黄病毒xrRNA在溶液中受Mg2+及PK2长度协同调控的折叠自由能面图(图1g)。这些研究成果揭示了黄病毒xrRNA的结构、构象动态与功能之间的高度相关性和由三级相互作用模体调控RNA构象动态与功能的新机制。
图2. 基于非天然碱基系统的长链RNA位点特异性荧光探针标记方法。
清华大学生命学院方显杨研究员与陈春来研究员为该论文的共同通讯作者。清华大学生命学院2016级博士毕业生牛晓林和2017级直博生孙瑞瑞为该论文共同第一作者。生命学院合作交流研究生陈志凤、2017级直博生姚溢融参与了研究工作。美国阿贡国家实验室左孝兵老师为SAXS数据的收集做出了重要贡献。该研究受到国家自然科学基金委、北京结构生物学高精尖创新中心、北京市生物结构前沿研究中心的经费支持。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-021-26616-x
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https://doi.org/10.1038/s41467-020-19260-4
https://doi.org/10.1039/d0sc01717e
https://doi.org/10.1073/pnas.2005217117
https://doi.org/10.1039/D1SC02633J
https://doi.org/10.1073/pnas.2002971117
