CIRSPR/Cas9是一种在单条guide RNA（gRNA）的指导下利用Cas9核酸酶对靶标DNA进行特异性识别和切割的技术。该过程涉及到Cas9/gRNA与双链DNA（dsDNA）非特异性的结合、在dsDNA上搜索并识别PAM位点、通过与PAM上游的同源匹配形成RNA/DNA异源双链从而实现在dsDNA上靶点区域的特异性结合和切割。由于Cas9可以高效快捷地靶向并切割dsDNA，因而被广泛地应用于基因编辑、基因表达调控、基因定位和成像等领域。但是，Cas9如何在大量DNA中快速定位其靶标尚不清楚。尽管有研究报道了Cas9在低盐浓度下利用三维和一维扩散模式搜索靶点，但缺乏阐释其在生理盐浓度下靶标搜寻这一动态过程的结构生物学基础和分子定量模型。
2021年8月20日，清华大学生命科学学院陈春来和刘俊杰课题组合作在《化学科学》（Chemical Science）杂志发表了题目为“spCas9与PAM下游DNA位点的非特异性相互作用加速其靶点搜索过程（Nonspecific interactions between SpCas9 and dsDNA sites located downstream of the PAM mediate facilitated diffusion to accelerate target search）” 的研究论文。该论文揭示了在生理盐浓度下，spCas9利用三维和一维扩散实现高效搜索靶点，其1151-1156位的赖氨酸残基与PAM下游 ~ 8 bp DNA位点的非特异性结合是介导一维扩散并造成PAM侧翼不对称一维搜索的主要原因。该文揭示了spCas9在生理盐浓度下的独特搜索靶点机制和相应的结构生物学基础，为Cas9体内和体外的应用提供了重要指导。
结合生化实验与单分子荧光技术，该研究发现，在生理盐浓度下，spCas9利用三维和一维扩散实现快速搜寻靶点。spCas9的一维扩散以PAM位点为中心展现出了不对称的搜索区域（从PAM上游 ~ 10 bp到PAM下游 ~ 30 bp），将靶标搜索效率提高了10倍以上。同时，结合Cas9/gRNA/DNA二聚体的单颗粒冷冻电镜结构和单分子荧光实验进一步揭示，PAM下游的~ 8 bp DNA位点与Cas9的1151-1156位赖氨酸残基（尤其是1153位赖氨酸）之间的存在紧密的非特异性相互作用，是介导Cas9一维扩散并导致PAM侧翼的不对称搜索区域的主要原因。而通过改变Cas9与DNA的相互作用，包括突变1151-1156位赖氨酸残基、降低缓冲体系的盐浓度以及改变PAM识别残基，都会影响其一维扩散的过程。
最后，该研究提出了spCas9搜索靶点的详细分子模型（图1）：在生理盐浓度下，溶液中自由扩散的Cas9/gRNA复合物通过三维随机碰撞与dsDNA相互作用。一旦通过1151-1156位赖氨酸残基与dsDNA非特异性相互作用，spCas9就会瞬时结合并沿dsDNA双螺旋进行~ 20 bp的一维扩散以寻找PAM位点。一旦搜索到同源靶标就会结合形成复合物，否则会被释放进入溶液并重新进入搜索过程。spCas9通过与PAM下游区域的非特异性结合使靶标搜索速率提高了10倍以上，该研究为spCas9 的靶标位点设计提供了重要指导。
清华大学生命科学学院陈春来研究员与刘俊杰研究员为本文共同通讯作者。清华大学生命科学学院CLS项目已毕业博士生杨梦铱（现为首都医科大学附属北京儿童医院营养与发育研究室研究实习员）为本文第一作者。生命学院17级博士生孙瑞瑞、结构生物学高精尖创新中心卓越学者邓谱涓, 医学院CLS项目17级博士生杨宇卓、王文娟高级工程师参与了本项目研究。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心、北京市生物结构前沿研究中心、清华-北大生命科学联合中心及国家自然科学基金委的经费支持。
论文链接：
https://doi.org/10.1039/D1SC02633J
课题组相关论文链接：
https://doi.org/10.1073/pnas.2002971117
https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.08.005
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.048
图1. spCas9蛋白搜索靶标DNA的分子机制模型
