合成生物学通过构建各类动态调控系统控制精确调控代谢通路，实现目标产物的生产和特定的细胞行为。然而在代谢工程领域，由于实验室构建的基因线路往往缺少鲁棒性，要想在大体积的发酵体系中实现生长对数期的中后期的动态调控依然有很大的挑战。简单的化学诱导开关由于诱导物的高成本、不可移除性已经不能满足生物生产的需求；光诱导系统在高细菌密度时难以穿透发酵罐进行精确调控；实验室构建的复杂的、多元件的开关在大尺度的发酵体系往往会失效。与其他感应系统相比，温度开关有低成本、快速响应、可移除等优势。工业生产已经有成熟的热质传递理论，因此在发酵罐体系能够比较容易进行温度调控。总体而言，温控开关有应用于大规模发酵的潜力。
生命学院陈国强团队于2021年3月3日在Nature Communications杂志上发表题为“在大肠杆菌中利用可逆温度调控开关实现双向动态调控”（Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli）的文章https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x ，论文利用由温度控制的双向动态调控开关，在7-L发酵罐中实现了生长对数期中后期的调控，实现了聚羟基脂肪酸酯（PHA）的精确组装，证明了温控开关用于大规模生产的潜力。在不同尺度实现组织调控：纳米级的生物高分子聚合物合成，微米级的单细菌形态控制，毫米级的细菌菌落“类树木年轮”菌落，证明了构建的温控开关具有普遍适用性和系统稳定性（图1）。
图1. 利用温控开关T-switch实现生物图案、细菌变形及高分子组装
论文首先基于温度敏感的转录因子CI857和TetR家族的转录抑制子PhlF构建出温度敏感的基因开关T-switch。在30℃和37℃时，编码绿色荧光蛋白的基因sfgfp和编码红色荧光蛋白的基因mrfp分别转录表达，经过一系列优化和表征，双向动态温度调控开关T-switch可以在温度在30℃和37℃之间实现不同基因的同时转录上调和下调。
随后T-switch被应用于三个不同的场景。第一个场景是受温度的季节性变化触发的树木年轮的启发，通过模仿“年轮”图案的形成过程，在平板上生成类年轮的细菌菌环，创造出新的不依赖于浓度信号差生成的图案（pattern），实现了毫米级的图案控制（图2）。通过对生物图案形成的探究与创造，可以为研究者审视生物发育、生长、形成图案提供新的思路。
图2. 类树木年轮的细菌菌落形成
第二个场景是细菌形态的变化，论文使用T-switch控制mreB和ftsZ基因，通过改变温度实现细菌从球形、杆状到纤维状动态变化，实现了单细胞微米级的形态控制（图3）。细菌产物有一大类是在胞内以“内涵体”形式存在的产物，包括PHA、糖原、聚氨基酸等。细胞体积大小决定了这些产物生产的上限，而细菌往往只有0.5-2μm大小，因此通过改变细菌的形状能够有效地改变“内涵体”产物的积累，越大越长的细菌能够使得胞内产物积累更多。另外通过对细菌形态的调节，使得细菌体积增大、细菌长度变长，提高了细菌与发酵液自动分离的能力，使得下游收集菌体过程更方便，能耗成本更低。
图3. 温度控制细菌形态的变化
第三个场景是细胞内高分子的精确组装。聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, PHAs）是一类主要由微生物合成，生物可降解且具有生物相容性的高分子材料，将有很大的潜力解决全球塑料污染问题。目前已经商业化的PHA例如PHBV，P3HB4HB以及PHBHHx，都是随机共聚物。而嵌段聚合物在随机聚合物的基础上不仅可以改善材料性能，还可以解决材料老化等问题【4】，但是由于PHA生产的相关碳源（前体）价格昂贵，不用葡萄糖等非相关碳源进行生产，是很难实现嵌段PHA的工业化，因此，通过使用具有成本效益的碳源来设计无诱导剂的PHA嵌段共聚物生产开关非常有必要。论文通过T-switch在大肠杆菌中控制3-羟基丁酸（3HB）和4-羟基丁酸（4HB）出现的时序，成功在7L发酵罐生成了4HB比例从30到89mol%的随机共聚物P（HB-co-4HB）和4HB比例从10到60mol%的嵌段共聚物P3HB-b-P4HB，随着4HB单体比例的变化，随机共聚物P（HB-co-4HB）的熔融温度从无到有、玻璃化转变温度降低、杨氏模量和拉伸应力增强、断裂延伸率保持在800%以上。和随机共聚物相比，相同4HB比例的嵌段共聚物P3HB-b-P4HB有PHB和P4HB的特征熔融温度峰、杨氏模量和拉伸应力显著高于随机共聚物，体现了更加优良的材料性能。上述实验在大尺寸的发酵罐复杂体系统完成了纳米级的聚合物的精确合成控制，证明了该系统的稳定性。
综上所述，本研究构建出一个温度控制可多次调控的双向动态调控开关，实现了菌落图案、细菌形态控制和PHA精确组装，并且能够在7-L发酵罐中细菌高密度发酵时实现动态调控。
清华大学生命学院、清华-北大生命科学联合中学博士生王宣及清华大学学堂班本科生韩佳宁（现康奈尔大学博士生）为论文的共同第一作者，清华大学生命学院陈国强教授及中科院深圳先进技术研究院合成生物学研究所叶健文为论文的共同通讯作者，生命学院博士生张旭、马悦原、林艺娜、王欢，北京大学物理学院硕士生李典杰，生命学院本科生郑陶然以及生命学院吴赴清副研究员参与该研究。该研究得到了科技部重大专项、国家自然科学基金委、清华-INDITEX持续发展基金的资助。
Wang, X., Han, JN., Zhang, X. et al. Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nat Commun 12, 1411 (2021). https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x
