2018年3月10日，清华大学生命学院杨雪瑞课题组在Nucleic Acids Research杂志在线发表方法学论文“De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data”（文章链接），详细介绍了一种使用核糖体分析（ribosome profiling）数据鉴定RNA的翻译并重构翻译组的新方法，RiboCode。这是杨雪瑞课题组在翻译组学研究领域的第二套信息挖掘方法。Ribosome profiling技术有两个不同的应用方向：翻译速率的定量比较与翻译事件的系统鉴定。此前，杨雪瑞课题组开发了ribosome profiling数据分析工具Xtail，用于基因翻译速率的定量比较，文章发表于Nature Communications（文章链接）。此次发表的RiboCode工具则针对第二个应用方向：鉴定RNA翻译活性并构建翻译组。
近年来，越来越多的证据表明经典的“编码/非编码基因”简单二分法并不准确。基因转录产物RNA的许多“非编码”序列，如5’UTR（5’ untranslated region）、非编码RNA（non-coding RNA）等，都存在开放读码框（open reading frame，ORF），其中一些ORF可能在特定条件下翻译形成小肽或蛋白质，并具有多种生物学功能。对于这些RNA来说，其翻译与否和细胞状态及环境相关，不能简单归类为编码或非编码RNA。因此，对转录组RNA中所有可能的ORF进行翻译活性的鉴定，构建特定生理条件下细胞的翻译组（translatome）成为RNA及蛋白质相关研究领域的迫切需求。
杨雪瑞课题组的一个重要研究方向为使用ribosome profiling技术系统分析肿瘤、发育等复杂生物学过程中的翻译调控机制，并同时进行相关实验技术及数据分析方法的开发。Ribosome profiling通过对核糖体保护的RNA片段（ribosome protected fragment，RPF）的深度测序分析，提出基因组范围的翻译状态图谱。翻译过程中，核糖体相对于RNA以密码子长度（3 nt）为单位移动。因此，以P-位点为基准，来源于正常翻译过程的RPF片段应该在RNA上呈现3碱基的周期性分布。这是判断一个RNA是否被翻译的直接证据。但是，ribosome profiling数据远非如此理想，多种因素都可能干扰对翻译的判断，例如RPF总体分布不均匀、覆盖率低、ORF长度差异大、P-位点判断误差、测序误差、RNA片段污染等等。因此，从核糖体分析数据中准确鉴定具有翻译活性的ORF需要高敏感、高准确度的方法流程。
杨雪瑞课题组针对此需求，设计了RiboCode方法，用于从核糖体分析数据中鉴定有翻译活性的RNA，最终构建全面的翻译组。在一系列测试中，RiboCode表现出优异的准确性、敏感性和分析效率，显著超越了现有的其它方法。文章中使用RiboCode方法分析了多套人类细胞、小鼠细胞、斑马鱼及酵母的ribosome profiling数据，鉴定了各种类型的非编码RNA或非编码片段的翻译，其中绝大多数是此前从未被注释过的。例如在酵母细胞中，RiboCode重构了正常生理条件、氧化应激、热激三种状态下的翻译组，其中UTR区的翻译，包括5’UTR的uORF及3’UTR的dORF，在应激条件下明显更加活跃，而且部分UTR的翻译水平与mRNA上相应的已知蛋白编码区翻译高度正相关或负相关。
总之，RiboCode方法帮助研究人员充分利用ribosome profiling这一技术挖掘细胞中的翻译信号，并全面重构特定生理状态下的翻译组，满足了翻译组学及RNA研究等领域的重大需求。该工具此前已向领域内同行公开，在文章发表前已有近600次下载。RiboCode与此前发表的Xtail方法覆盖了ribosome profiling数据的两大主要分析方向：翻译效率的定量比较与翻译活性的系统鉴定。目前实验室正致力于使用这些工具协助针对肿瘤、发育等重要生物学过程的翻译组学与翻译调控机制研究。
清华大学生命学院2013级博士生肖正涛为本文的第一作者，杨雪瑞研究员为本文的通讯作者。研究工作得到了生命学院邓海腾课题组在质谱数据分析方面的帮助。本研究由国家重点研发计划“精准医学研究”重点专项、国家自然科学基金委、清华-北大生命科学联合中心、清华大学自主科研项目提供经费支持。清华大学蛋白质研究技术中心生物计算平台提供了计算资源的支持。
RiboCode文章链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gky179/4925760
软件下载地址：https://github.com/xryanglab/RiboCode
Xtail文章链接：
http://www.nature.com/ncomms/2016/160404/ncomms11194/full/ncomms11194.html
软件下载地址：https://github.com/xryanglab/xtail
RiboCode方法流程
使用RiboCode构建酵母细胞翻译组
