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冷冻超薄切片应用及送样须知

1. 冷冻超薄切片的应用主要有以下几个方面:

(1)可以实现常温下柔软材料样品的超薄切片制备,切片温度因不同材料的玻璃化温度而异,最低可达-160℃。例如聚苯乙烯、聚异戊二烯-聚苯乙烯共聚物等。

(2)高压冷冻或快速冷冻后,-140℃以下对冷冻含水样品进行切片,后续在冷冻电镜下观察,即CEMOVIS技术。

(3)生物样品蔗糖浸透后,-120℃进行切片,恢复至室温后对切片进行免疫标记,即Tokuyasu技术。Tokuyasu技术是一种高效的免疫标记的方法,对抗原的保存较好。

2. 针对不同的样品及应用,送样要求如下:

(1)材料样品:送样时需要注明样品的玻璃化温度,捞片使用铜网的类型。

(2)蛋白质晶体类样品:高浓度样品

(3)Tokuyasu技术:样品用多聚甲醛或含有极少量戊二醛的多聚甲醛混合固定液(0.1M PB 缓冲液配置),固定1至数小时后送样(对于戊二醛的浓度问题,需要提前设定浓度梯度进行预试验),

关于标记效率问题取决于以下两点:(1)抗原的表达量;(2)抗体。

3. 对用户的要求

(1)样品要求:尽量提供稳转细胞或组织,同时用户需要明确抗原的定位,方便后续评估是否存在非特异性标记问题。

(2)用户需要查找已发表文献中用过的抗体的品牌和货号,平台目前可以提供GFP抗体(ab6556)(适用于: IHC-FoFr, Electron Microscopy, IHC-P, IHC-Fr, IP, WB, ICC/IF, Flow Cyt)。

(3)样品进行冷冻超薄切片免疫标记前,首先进行冷冻半薄切片,用户对半薄切片进行免疫荧光标记实验,以确定免疫电镜标记所用抗体浓度、时间以及初步判断被标记的细胞的量,方便用户了解所提供样品抗原的表达量。

(4) 平台培训用户进行免疫电镜标记,最后一步染色平台负责。对细胞器标记效果如下图,细胞膜为负染效果。

G:高尔基体;TGN: 反面高尔基网状结构;E:内体

Slot JW et al. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2007; 2(10):2480-91.

4. 制样时间及联系方式

(1)Tokuyasu制样时间:每周二和周四下午进行,请合理安排时间送样,如有问题,欢迎致电咨询。

(2)联系方式:

清华大学蛋白质研究技术中心细胞冷冻电镜平台

李英 liying@biomed.tsinghua.edu.cn ,

15210186244 /010-62771601,郑裕彤医学楼E220

 

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